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蛋白表達的常見(jiàn)問(wèn)題

 更新時(shí)間:2024-06-19 點(diǎn)擊量:258
  蛋白表達實(shí)驗的時(shí),有時(shí)候實(shí)驗會(huì )覺(jué)得參考實(shí)驗方法和克隆的蛋白基因序列完q沒(méi)有問(wèn)題,但蛋白電泳就是沒(méi)有結果。那么你知道蛋白表達的常見(jiàn)問(wèn)題有哪些嗎?讓我們一起來(lái)看看吧!
  1、載體構建錯誤,很多克隆新人常常弄錯讀碼框。比如Qiagen的pQE系列載體,其復制位點(diǎn)常有一兩個(gè)堿基的差異;另外有些酶產(chǎn)生粘端有些酶產(chǎn)生平端,這些都容易導致讀碼框錯誤,從而無(wú)法表達出來(lái)。
  2、宿主菌選擇不當。不同的宿主菌其基因型是不同的。有些經(jīng)過(guò)特殊修飾的載體,或者特殊用途的載體,或者有特殊啟動(dòng)子的載體,必須選擇適合的宿主菌進(jìn)行表達。因此,當你的蛋白沒(méi)有表達出來(lái)時(shí),可以考慮更換宿主菌。
  3、密碼子的使用頻率較低。有些基因其本身含有許多罕見(jiàn)密碼子,尤其是起始密碼之后的15個(gè)堿基之內的罕見(jiàn)密碼子,對蛋白表達有著(zhù)很重要的影響。優(yōu)化密碼子對原核表達似乎效果很好,對真核表達系統未必有很好的效果。
  4、質(zhì)粒不穩定或者質(zhì)粒丟失。pET系統通常相對較穩定。但是你選用帶氨芐青霉素抗性的載體時(shí),也許有可能產(chǎn)生β-lactamase降解了抗生素,使質(zhì)粒丟失。還有一種情況是表達重組的毒素蛋白,對宿主細胞也具有毒性,導致質(zhì)粒丟失。這種情況在真核表達系統中較為常見(jiàn)。
  5、蛋白酶將蛋白降解了。這種情況通常由重組蛋白本身的N-或C-端序列引起。當蛋白N-端是Arg,Leu,Lys,Phe,Trp,或Tyr這些氨基酸時(shí),容易受到蛋白酶降解,這就是所謂的N-末端規則。如果N-端是Met時(shí),大腸桿菌可以偷偷地將這個(gè)Met去掉,尤其是Met之后緊跟著(zhù)一個(gè)帶有小側鏈的氨基酸時(shí)。而C-末端存在非極性氨基酸時(shí),也容易導致蛋白被降解。如果C末端最后5個(gè)氨基酸是極性的或者帶電荷的,則不容易被降解。
  6、二級翻譯起始位點(diǎn)。這種情況出現在你的序列中恰好包含與核糖體結合位點(diǎn)完q相同的序列。那就怪不得了,核糖體會(huì )非常高興地找到這個(gè)位點(diǎn),然后開(kāi)始翻譯,導致你的蛋白被截短,在電泳時(shí)無(wú)法看到預期大小的片段。
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