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脂質(zhì)體轉染的原理與方法

 更新時(shí)間:2024-05-17 點(diǎn)擊量:100
  脂質(zhì)體作為體內和體外輸送載體的工具,已經(jīng)研究的十分廣泛,中性脂質(zhì)體是利用脂質(zhì)膜包裹DNA,借助脂質(zhì)膜將DNA導入細胞膜內。帶正電的陽(yáng)離子脂質(zhì)體,DNA并沒(méi)有預先包埋在脂質(zhì)體中,而是帶負電的DNA自動(dòng)結合到帶正電的脂質(zhì)體上,形成DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復合物,從而吸附到帶負電的細胞膜表面,經(jīng)過(guò)內吞被導入細胞。下面讓我們一起來(lái)看看脂質(zhì)體轉染的原理與方法吧!
  脂質(zhì)體轉染操作步驟
  進(jìn)行實(shí)驗之前,請先規劃好實(shí)驗,一般細胞轉染需要24h-72h,所以要充分了解細胞生長(cháng)速度,計算所需脂質(zhì)體和DNA的儲備量,并確認準備好所需試劑:Opti-MEM無(wú)血清培養基,Lipofectamine轉染試劑,以及DNA。
  1、細胞鋪板
 ?。?)一般會(huì )選擇復蘇細胞傳代3-4次,從解凍過(guò)程中恢復過(guò)來(lái)可以穩定生長(cháng)的細胞進(jìn)行細胞轉染,傳代次數高(>30-40)時(shí),細胞的生長(cháng)速度和形態(tài)會(huì )改變。
 ?。?)如果提總蛋白,一般選擇六孔板進(jìn)行轉染,因為轉染的細胞提取蛋白的總量能達到200ug,一般夠做并且需要的DNA和Lipofectamine又相對比較少。
 ?。?)傳代條件取決于所用的細胞系。對于快速生長(cháng)的細胞,倍增時(shí)間為16小時(shí)(如HEK293)。對于生長(cháng)緩慢的細胞,倍增時(shí)間為36小時(shí)(如原代細胞)。
 ?。?)轉染當天,將細胞鋪板。如果在轉染前一天或更早時(shí)間鋪板,轉染效率可能下降,如果是簡(jiǎn)單細胞系的轉染,可以直接在前一天晚上鋪板,第二天來(lái)轉染。轉染時(shí),細胞密度會(huì )影響轉染效率,細胞密度保持在匯合率為70-90%(這個(gè)前提是轉染24h,如果轉染48h則需要匯合率為50-70%),細胞的鋪板和轉染也可同時(shí)進(jìn)行。
  2、細胞轉染
  吸去培養皿中的培養基,用PBS或者無(wú)血清培養基清洗一次。更換無(wú)血清培養基。準備轉染制備液,用滅菌后的EP管制備。以六孔板為例,A液:用200μl Opti-MEM稀釋4μg質(zhì)粒;B液:用200μl Opti-MEM稀釋10μl lipo2000,分別將A液、B液輕輕混勻,靜置5min,吸取B液加入至A液中,輕輕混勻,室溫靜置20min。加入轉染試劑到每個(gè)孔的培養基中,6h后,更換成完q培養基,繼續培養到24-48小時(shí)(不同的質(zhì)粒和脂質(zhì)體最佳搭配比例不同,轉染前,應該摸一個(gè)最佳配比。質(zhì)粒:脂質(zhì)體=1:1,1:1.5,1:2,1:2.5,1:3,1:3.5的梯度比例來(lái)檢測最佳轉染比例,一般質(zhì)粒有帶熒光,可以通過(guò)觀(guān)察每組熒光強弱來(lái)判斷轉染效率)。以下為不同規格的培養板需要加DNA和lipo2000的量。
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